De secundaire behandeling verwijdert de oplosbare organische stoffen, nutriënten zoals stikstof en fosfaat, en de meeste gesuspendeerde vaste stoffen die aan de primaire behandeling ontsnappen. Meestal worden biologische processen toegepast waarin microbes organische verbindingen en voedingsstoffen helpen kweken en reproduceren. De twee meest voorkomende biologische secundaire behandelingsprocessen zijn gefixeerde groei- en gesuspendeerde groeisystemen. Een gesuspendeerd groeiproces bevordert de groei van gesuspendeerde vlokken van individuele micro-organismen die reeds aanwezig zijn in het afvalwater en in de retourstroom voor actief slib. De vlokken bevatten organismen die de verontreinigende stoffen kunnen verwijderen via aërobe, anoxische en anaërobe omgevingen. Nadat de verontreinigende stoffen zijn verwijderd, gaan de vlokken naar een nabezinkingsproces, waar ze door middel van zwaartekracht van het water worden gescheiden. Een deel van het slib op de bodem van het nabezinkbassin gaat vervolgens terug stroomopwaarts om een mengsel te vormen met het primaire effluent (retourstroom voor actief slib) om een slib-watermengsel te creëren. De rest van het slib wordt verwijderd uit het proces (overtollig actief slib) om de ideale ecologie van micro-organismen te creëren. De gefixeerde groeisystemen maken gebruik van micro-organismen die zich aan media hechten en een biofilm creëren. Het bezonken rioolwater wordt gemengd met of verspreid over het medium met de biofilmcoating, waarna de micro-organismen de verontreinigende stoffen verwijderen. Net als bij het gesuspendeerde groeiproces, worden biofilmfragmenten en gesuspendeerde vlokken naar een nabezinkbassin gestuurd voor scheiding. Daar wordt het slib gerecycled en afgevoerd en wordt schoon water naar het volgende proces gevoerd.
Voor een efficiënt functionerende biologische behandeling hebben organismen nutriënten nodig in een evenwichtige verhouding, met inbegrip van koolstof, stikstof, en fosfaat (aangeduid als C:N:P), evenals spoorelementen met inbegrip van ijzer, koper, zink, nikkel, mangaan, kalium, zwavel en andere componenten die gewoonlijk aanwezig zijn in afvalwater. De algemeen aanvaarde C:N:P-verhouding is 100:5:1, hoewel sommige installaties gedijen buiten deze verhouding. Andere installaties krijgen echter te maken met de vorming van polysaccharideslijm of draadvormige bacteriën die de biologie blokkeren en bezinken in het nabezinkbassin.
Er kunnen meerdere biologische processen worden gebruikt voor de secundaire behandeling, waaronder propstroombeluchtingsbassins, beluchtingstanks voor volledige mengsels, Sequencing Batch Reactors, oxidatesloten, continufilters, biologische reactors met bewegend bed, geïntegreerd actief slib met vaste film en meer.
Biologische nutriëntverwijdering (BNR) verandert het milieu van de micro-organismen om stikstof en fosfaat uit het water te verwijderen. Een BNR-proces bestaat uit anaërobe (geen zuurstof of nitraat), anoxische (geen zuurstof, nitraat aanwezig) en aërobe (zuurstof aanwezig) stadia, waarin het water wordt verplaatst door een reeks kamers om verschillende biologische functies uit te voeren.
Er kunnen ook chemische behandelingsprocessen worden gebruikt, zoals chemische verwijdering van fosfaat. Door de aanvoer van een chemisch neerslagmiddel binnen het beluchtingsbassin en de bezinkbassins wordt fosfaat verwijderd door middel van flocculatie, waardoor verbindingen van onoplosbare stoffen ontstaan die naar beneden zakken en kunnen worden verwijderd als slib.